Organoids and fish, models for a rare disease

Aquariums d'élevage de poissons-zèbres. Ce poisson grégaire vit parmi un banc de 8 à 10 individus au minimum. Il peut vivre jusqu’à 3 ans et atteindre 4 cm de long en aquarium. Le poisson-zèbre a le corps couvert de bandes horizontales, d'où son nom. La similarité génétique et physiologique du poisson-zèbre "Danio rerio" avec les humains, et le développement "ex utero" des embryons, fait de lui un modèle animal attrayant pour la recherche. C'est notamment le cas pour l'étude de maladies…

Préparation de l'accouplement de poissons-zèbres. Un couple de poissons-zèbres (un individu femelle et un individu mâle) est isolé par un séparateur transparent dans un bac de reproduction. Le poisson-zèbre est une espèce ovipare à fécondation externe. Après échange de phéromones avec la femelle pendant la nuit, le mâle s'accouple en pressant le ventre de sa partenaire, afin qu'elle expulse ses ovocytes qu'il fécondera ensuite dans l'eau. Le séparateur permet de réguler le moment de l…

Préparation de l'accouplement de poissons-zèbres. Un couple de poissons-zèbres (un individu femelle et un individu mâle) est isolé par un séparateur transparent dans un bac de reproduction. Le séparateur permet de réguler le moment de l'accouplement et donc de la ponte, afin d'obtenir une grande quantité d'œufs fécondés au même moment. Après avoir passé une nuit dans ce bac, durant laquelle la libération de phéromones mâles va stimuler l'ovulation de la femelle, le séparateur est retiré afin…

Poissons-zèbres adultes dans leurs aquariums d'élevage. Ce poisson grégaire vit parmi un banc de 8 à 10 individus au minimum. Il peut vivre jusqu’à 3 ans et atteindre 4 cm de long en aquarium. Il a le corps couvert de bandes horizontales, d'où son nom. La similarité génétique et physiologique du poisson-zèbre "Danio rerio" avec les humains, et le développement "ex utero" des embryons, fait de lui un modèle animal attrayant pour la recherche. C'est notamment le cas pour l'étude de maladies…

Poissons-zèbres adultes dans leurs aquariums d'élevage. Ce poisson grégaire vit parmi un banc de 8 à 10 individus au minimum. Il peut vivre jusqu’à 3 ans et atteindre 4 cm de long en aquarium. Le poisson-zèbre a le corps couvert de bandes horizontales, d'où son nom. La similarité génétique et physiologique du poisson-zèbre "Danio rerio" avec les humains, et le développement "ex utero" des embryons, fait de lui un modèle animal attrayant pour la recherche. C'est notamment le cas pour l'étude de…

Œufs fécondés de poissons-zèbres collectés dans une boîte de Petri. Les œufs, collectés dans les 20 minutes suivant leur fécondation, se composent d'une cellule surmontant un sac vitellin (en gris) entourés d'une membrane transparente appelée chorion. Ces œufs fécondés, fraichement récoltés, seront injectés avec des oligonucléotides modifiés appelés morpholinos, pour altérer l'expression de gènes cibles, impliqués dans le syndrome de Taybi-Linder. La similarité génétique et physiologique du…

Installation d'une micro-aiguille sur un porte aiguille pour injecter des embryons de poisson-zèbre. L'injection est réalisée à l'aide d'un système très précis et très reproductible, d'injection d'air sous pression. L'appareil propulse de l'air à travers un tube, au bout duquel se trouve l'aiguille d'injection, remplie de la solution à injecter. Ici, l'aiguille est chargée du mix d'injection qui contient un colorant rouge, le Phenol Red, permettant de visualiser le site d'injection dans l…

Embryons de poissons-zèbres observés sous une loupe binoculaire. Ils ont été récupérés et placés dans une boîte de Petri. Ils sont à leur stade le plus précoce, le stade dit "1-cellule". Chaque embryon est entouré d'une membrane externe, le chorion, qu'il faudra percer afin de réaliser une injection au cœur de l'embryon, juste à la base de la cellule unique. L'injection contient un colorant rouge, le Phenol Red, permettant de visualiser le site d'injection dans l'embryon et des oligonucléotides…

Alignement d'œufs fécondés de poissons-zèbres. Afin de réaliser les injections plus rapidement et aisément, les œufs sont alignés et bloqués dans une gélose prévue à cet effet, à l'aide d'une pince. Les rainures visibles dans la gélose, sont calibrées de façon à ce que les œufs puissent s'y loger et qu'ils ne bougent pas au cours de l'injection. Cette dernière contient un colorant rouge, le Phenol Red, permettant de visualiser le site d'injection dans l'embryon et des oligonucléotides modifiés,…

Œufs fécondés de poissons-zèbres alignés dans une boîte de Pétri et observés sous une loupe binoculaire. Afin de réaliser les injections plus rapidement et aisément, les œufs ont été alignés et bloqués dans une gélose prévue à cet effet. Cette disposition des œufs est optimale pour pouvoir injecter de façon rapide et précise. L'injection contient un colorant rouge, le Phenol Red, permettant de visualiser le site d'injection dans l'embryon et des oligonucléotides modifiés, appelés morpholinos,…

Microinjection d'œufs fécondés de poissons-zèbres. Une fois le volume calibré, le système d'injection prêt et les embryons alignés, les injections peuvent être réalisées. La petite taille des œufs et de l'aiguille nécessite de travailler sous loupe binoculaire. L'injection contient un colorant rouge, le Phenol Red, permettant de visualiser le site d'injection dans l'embryon et des oligonucléotides modifiés, appelés morpholinos, qui bloquent l'expression du gène impliqué dans le syndrome de…

Microinjection d'œufs fécondés de poissons-zèbres. Elle est réalisée sous loupe binoculaire à l'aide d'une fine aiguille qui permet de transpercer les œufs et d'introduire la solution dans la cellule. L'injection contient un colorant rouge, le Phenol Red, permettant de visualiser le site d'injection dans l'embryon et des oligonucléotides modifiés, appelés morpholinos, qui bloquent l'expression du gène impliqué dans le syndrome de Taybi-Linder. La similarité génétique et physiologique du poisson…

Sélection de poissons-zèbres mâles et femelles en vue de leur reproduction. Dans ce bac contenant des individus d'une même lignée, les mâles et les femelles sont sélectionnés et seront mis en accouplement le lendemain matin, pour obtenir des embryons fécondés à injecter. Ici, ce que les scientifiques veulent injecter, ce sont des oligonucléotides modifiés, appelés morpholinos, qui bloquent l'activité d'un petit ARN, mimant ainsi ce qui se produit chez des patients atteints du syndrome de Taybi…

Vue d'ensemble de l'animalerie aquacole du Plateau de recherche expérimentale en criblage in vivo (PRECI) de la Structure fédérative de recherche Biosciences, située à l’Institut de génomique fonctionnelle de Lyon. Elle accueille l’élevage des poissons-zèbres, modèle animal utilisé dans le cadre du projet de recherche sur le syndrome de Taybi-Linder. La similarité génétique et physiologique du poisson-zèbre "Danio rerio" avec les humains, et le développement "ex utero" des embryons, fait de lui…

Observation d'embryons de poissons-zèbres à la loupe binoculaire pour voir leur morphologie globale. L'impact de l'injection d'oligonucléotides modifiés, appelés morpholinos, est évalué sur le développement de l'embryon à 48 heures post-fécondation. Ces morpholinos bloquent spécifiquement la fonction d'un petit ARN, mimant ainsi ce qui se produit chez des patients atteints du syndrome de Taybi-Linder. Par cette approche, il est possible de reproduire chez le poisson-zèbre ce qui est observé…

Dépôt d'un échantillon de protéines sur un gel de polyacrylamide. Les mutations génétiques responsables du syndrome de Taybi-Linder entrainent des modifications des ARN messagers, qui vont être ensuite traduits en protéines. Il est possible d’identifier les répercussions des mutations sur les protéines en les analysant par une technique appelée "western blot". Les protéines extraites des cellules différenciées en neurones sont déposées sur un gel de polyacrylamide en vue de réaliser une…

Révélation de protéines spécifiques à l’aide d’un système d’imagerie par chimioluminescence. Les bandes correspondant à des protéines d'intérêt sont ainsi visualisées et les bandes de forte intensité indiquent une forte teneur en protéines. Les mutations génétiques responsables du syndrome de Taybi-Linder entrainent des modifications des ARN messagers, qui vont être ensuite traduits en protéines. Il est possible d’identifier les répercussions des mutations sur les protéines en les analysant par…

Pipetage d'un milieu de culture pour les cellules utilisées pour la culture d'organoïdes. À mi-chemin entre les modèles in vivo et in vitro, les organoïdes sont des modèles cellulaires ex vivo en trois dimensions qui dérivent de cellules souches (cellules indifférenciées). Ils peuvent être considérés comme de "mini-organes" ayant une architecture voire même une fonctionnalité représentative du vivant. L’obtention d’organoïdes corticaux requiert, dans un premier temps, un milieu riche en…

Entretien de cultures d'organoïdes cérébraux. À mi-chemin entre les modèles in vivo et in vitro, les organoïdes sont des modèles cellulaires ex vivo en trois dimensions qui dérivent de cellules souches (cellules indifférenciées). Ils peuvent être considérés comme de "mini-organes" ayant une architecture voire même une fonctionnalité représentative du vivant. Les organoïdes cérébraux sont répartis dans une plaque de 96 puits (un organoïde par puits), à faible adhérence, permettant l'agrégation…

Cultures d'organoïdes cérébraux dans des plaques multipuits. À mi-chemin entre les modèles in vivo et in vitro, les organoïdes sont des modèles cellulaires ex vivo en trois dimensions qui dérivent de cellules souches (cellules indifférenciées). Ils peuvent être considérés comme de "mini-organes" ayant une architecture voire même une fonctionnalité représentative du vivant. Les organoïdes cérébraux sont répartis dans une plaque de 96 puits (un organoïde par puits), à faible adhérence, permettant…

Observation au microscope confocal à balayage laser de coupes d'organoïdes cérébraux. À mi-chemin entre les modèles in vivo et in vitro, les organoïdes sont des modèles cellulaires ex vivo en trois dimensions qui dérivent de cellules souches (cellules indifférenciées). Ils peuvent être considérés comme de "mini-organes" ayant une architecture voire même une fonctionnalité représentative du vivant. Le microscope confocal à balayage laser permet d'analyser la structure fine de cellules ou de…

Observation au microscope confocal à balayage laser d'un progéniteur neuronal en cours de division en deux cellules filles. Un progéniteur neuronal est une cellule qui se divise pour former des neurones. Dans le contexte de la recherche sur le syndrome de Taybi-Linder, l'utilisation de cellules souches, qui peuvent être différenciées en progéniteurs neuronaux, permet d'explorer spécifiquement les aspects cellulaires et les mécanismes pathologiques associés à cette maladie génétique rare, qui se…

Réalisation de coupes fines d'organoïdes cérébraux au cryostat. À mi-chemin entre les modèles in vivo et in vitro, les organoïdes sont des modèles cellulaires ex vivo en trois dimensions qui dérivent de cellules souches (cellules indifférenciées). Ils peuvent être considérés comme de "mini-organes" ayant une architecture voire même une fonctionnalité représentative du vivant. L'échantillon biologique (l'organoïde cérébral) qui doit être analysé par immunofluorescence est inclus dans une matrice…

Observation d'embryons de poissons-zèbres à la loupe binoculaire 48h après fécondation. Une grande partie des anomalies de développement observées chez les patients atteints du syndrome de Taybi-Linder est due à des dysfonctionnements également présents dans l’embryon morphant (à droite), qui se traduisent, entre autres, par une courbure du corps. L'embryon morphant est appelé ainsi car des morpholinos lui ont été injectés, ce sont des oligonucléotides modifiés qui bloquent l'expression du gène…

Coupe d'un organoïde cérébral issu de cellules d’un donneur sain analysée au microscope confocal à balayage laser. Les progéniteurs neuronaux (colorés en rose), cellules qui se divisent pour former des neurones, sont nombreux, formant des structures en rosettes. À mi-chemin entre les modèles in vivo et in vitro, les organoïdes sont des modèles cellulaires ex vivo en trois dimensions qui dérivent de cellules souches (cellules indifférenciées). Ils peuvent être considérés comme de "mini-organes"…

Coupe d'un organoïde cérébral issu de cellules d’un patient atteint du syndrome de Taybi-Linder analysée au microscope confocal à balayage laser. Les progéniteurs neuronaux (colorés en rose), cellules qui se divisent pour former des neurones, sont moins nombreux qu’attendus, ce qui pourrait expliquer pourquoi les patients ont des anomalies cérébrales. L’étude de ces modèles permettra de mieux comprendre les défauts cellulaires à l’origine de ces anomalies. À mi-chemin entre les modèles in vivo…